1α, 25-дигидроксивитамин D₃ ингибирует ангиогенез In Vitro и In Vivo

D. J. Mantell, P. E. Owens, N. J. Bundred, E. B. Mawer, and A. E. Canfield

Originally published 4 Aug 2000 Circulation Research. 2000;87: 214–220

Абстракт

В настоящее время модуляция ангиогенеза является общепризнанной стратегией профилактики и лечения патологий, классифицируемых по степени их зависимости от сосудистого снабжения. Целью настоящего исследования была оценка влияния 1α, 25-дигидроксивитамина D3 [1,25(OH)2D3]- активного метаболита витамина D3 на ангиогенез с использованием хорошо охарактеризованных модельных систем in vitro и in vivo. 1,25 (OH) 2D3 (от 1×10-9 до 1×10-7 моль/л) значительно ингибировал прорастание и удлинение эндотелиальных клеток, индуцированных сосудистым эндотелиальным фактором роста (VEGF) in vitro дозозависимым образом и оказывал небольшое, но значительное ингибирующее действие на пролиферацию эндотелиальных клеток, индуцированную VEGF. 1,25 (OH) 2D3 также ингибирует образование сетей удлиненных эндотелиальных клеток в 3D коллагеновых гелях. Добавление 1,25 (OH) 2D3 к культурам эндотелиальных клеток, содержащих прорастающие удлиненные клетки, индуцировало регрессию этих клеток при отсутствии какого-либо воздействия на клетки, присутствующих в виде монослоя. Анализ ядерной морфологии, целостности ДНК и ферментативной маркировки разрывов нитей in situ, вызванных апоптозом, показал, что эта регрессия была обусловлена индукцией апоптоза именно в популяции прорастающих клеток. Влияние 1,25 (OH)2 D3 на ангиогенез in vivo было исследовано с использованием модели, в которой клетки рака молочной железы MCF-7, которые были индуцированы к сверхэкспрессии VEGF, были ксенотрансплантированы подкожно вместе с клетками рака молочной железы MDA-435S голым мышам. Лечение 1,25 (OH) 2D3 (12,5 пмоль/сут в течение 8 недель) приводило к образованию опухолей, которые были менее васкуляризованы, чем опухоли, образовавшиеся у мышей, получавших только индифферентный раствор. Эти результаты подчеркивают потенциальное использование 1,25 (OH) 2D3 как в профилактике, так и в регрессии состояний, характеризующихся патологическим ангиогенезом.

Ключевые слова: эндотелий, ангиогенез, апоптоз, витамин D3, факторы роста

---

Ангиогенез — образование новых кровеносных сосудов из существующего сосудистого русла, имеет фундаментальное значение в ряде физиологических и патологических процессов, включая атеросклероз, диабетическую ретинопатию, псориаз, рост опухолей и метастазирование (1, 2). Ангиогенный процесс характеризуется рядом стадий: (1) деградация базальной мембраны сосудов, (2) прорастание, удлинение, миграция и пролиферация эндотелиальных клеток, (3) объединение эндотелиальных клеток в новые канальцевые каналы (4) и синтез новой базальной мембраны, рекрутирование периваскулярных клеток и созревание сосудов (3). Эти процессы жестко контролируются через баланс положительных и отрицательных регуляторных факторов (2).

Фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) является ключевым медиатором ангиогенеза. Этот фактор роста стимулирует пролиферацию эндотелиальных клеток, прорастание, миграцию и морфогенез, действуя через 2 высокоаффинных рецепторных тирозинкиназ класса II, VEGF-R1 (flt-1) и VEGF-R2 (KDR/flk-1).(5) VEGF также является фактором выживания для вновь образованных сосудов (6,7) и необходим для эмбрионального развития, поскольку мыши с дефицитом VEGF, VEGF-R1 или VEGF-R2 умирают в утробе от сосудистых дефектов.(4, 5)

Зависимость многих патологических состояний от ангиогенеза привела к предположению, что такие заболевания можно контролировать с помощью антиангиогенных соединений, которые ингибируют или регрессируют вновь формирующиеся кровеносные сосуды (2). Влияние 1α, 25-дигидроксивитамина D3 [1,25 (OH)2D3] на ангиогенез неясно, поскольку сообщалось, что он уменьшает (8) или не влияет (9,10) на пролиферацию эндотелиальных клеток, не влияет на формирование капиллярных трубчатых структур in vitro (11) и ингибирует ангиогенез in vivo (12).

Целью настоящего исследования было изучение влияния 1,25 (OH) 2D3 на пролиферацию, прорастание и удлинение эндотелиальных клеток и их последующую ассоциацию в многоклеточные шнуры и трубчатые структуры с использованием хорошо охарактеризованных модельных систем in vitro (13, 14, 15). Влияние 1,25 (OH) 2D3 на рост опухоли и ангиогенез in vivo было исследовано на модели опухоли с использованием клеток, которые были индуцированы к сверхэкспрессии VEGF (16). Соответственно, мы демонстрируем, что 1,25(OH)2D3 ингибирует ангиогенез как in vitro, так и in vivo. Кроме того, мы показываем, что 1,25(OH)2D3 специфически индуцирует регрессию предварительно сформированных ростков эндотелиальных клеток, многоклеточных шнуров и сетей удлиненных эндотелиальных клеток in vitro, и мы демонстрируем участие апоптоза в этом процессе.

Материалы и методы

Клеточные культуры

Бычьи эндотелиальные клетки аорты (БЭКА) культивировали в 10% FCS-MEM (минимальная эссенциальная среда (МЕМ) плюс 10% фетальная телячья сыворотка (FCS)) на чашках, покрытых желатином (13). Затем при смене среды каждые 2 дня добавляли рекомбинантные человеческие VEGF (VEGF165, 20 ng/mL, from Dr D. Ogilvy, AstraZeneca Pharmaceuticals, Macclesfield, UK) и 1,25(OH)2D3 (1×10−9 to 1×10−7 mol/L, Roche). Контрольные культуры получали только индифферентное вещество (эталонный раствор - контроль) 10 мкл этанола/мл. В каждом эксперименте использовались дубликаты посуды.

Анализ распространения

Сначала БЭКА покрывали 10% FCS-MEM, а через 24 часа добавляли VEGF с 1,25 (OH)2D3 или без него в 2% FCS-MEM или в сыворотку без MEM. Пролиферацию оценивали путем подсчета количества клеток на 1-й и 613-й дни и измерения включения тимидина [3Н] в нерастворимый в трихлоруксусной кислоте (17).

Ангиогенез In Vitro

Сливающиеся БЭКА инкубировали в 2% FCS-MEM, содержащем VEGF с 1,25(OH)2D3 или без него в течение 14 дней. Ангиогенез определяли количественно с помощью компьютерной системы анализа изображений (Quantimet 600). Были оценены два поперечных диаметра, поле за полем (20 полей на тарелку). Вытянутые прорастающие клетки были очерчены цифровым способом, и площадь, занятая этими клетками, была рассчитана и выражена в процентах от общей площади поля. Влияние 1,25 (OH)2D3 на предварительно сформированные ростки эндотелиальных клеток исследовали путем инкубации конфлюентных эндотелиальных клеток с VEGF в течение 4 дней перед добавлением 1,25(OH) 2D3.

Влияние 1,25 (OH) 2D3 на более поздние стадии ангиогенеза было исследовано путем культивирования клеток в 3D коллагеновых гелях (13). Через 2 часа в 10% FCS-MEM клетки культивировали в 2% FCS-MEM с 1,25(OH)2D3 или без него в течение 5 дней. Для определения влияния 1,25 (OH)2D3 на предварительно сформированные сети удлиненных эндотелиальных клеток в коллагеновых гелях через 4 дня культивирования добавляли 1,25(OH) 2D3 в 10% FCS-MEM.

Анализы апоптоза

Апоптоз оценивали с помощью набора in Situ Cell Death Detection Kit (Boehringer-Mannheim). Ядра клеток исследовали методом флуоресцентной микроскопии после окрашивания акридиновым оранжевым. Оценивали целостность ДНК, выделенной из клеток, культивируемых на покрытых желатином чашках в присутствии VEGF и 1,25(OH)2D3 (18).

Анализы In Vivo

Самкам мышей BALB (мыши альбиносы) в возрасте 6 недель, были сделаны 2 дорсальные подкожные имплантации под галотановой анестезией: медленное высвобождение гранул эстрадиола (1 мг) и 14-дневный микро-осмотического насоса, который вышел 12.5 пмоль/D в 1,25(он)2D3 в гликоле пропилена (4 мыши) или (4 мыши).

Шесть дней спустя каждая мышь получила под флуотановой анестезией подкожную имплантацию 107 клеток рака молочной железы MCF7, трансфицированных VEGF плюс 107 клеток рака молочной железы MDA-435S (16). Насосы были заменены через 14 дней. Через 28 дней они получали 1,25 (OH) 2D3 и эстрадиол в виде еженедельных подкожных инъекций пропиленгликоля. Рост опухоли контролировался еженедельно. Через 8 недель мыши были убиты избытком анестетика, и опухоли были собраны. Проводили гистохимическое окрашивание замороженных срезов опухоли и оценку плотности микрососудов (16). MEC13.3 (rat anti-mouse CD31) был любезно предоставлен доктором А. Векки, Милан, Италия. Эксперименты проводились в соответствии с руководящими принципами Министерства внутренних дел Великобритании.

Статистика

Различия между непрерывными переменными были исследованы с помощью t-критерия Стьюдента. Множественные сравнения непрерывных данных были исследованы методом 1-way ANOVA с пост-hoc сравнениями по методу Бонферрони. Сравнение пропорциональности проводилось путем вычисления Z-статистики. U-критерий Манна-Уитни использовался для сравнения плотности микрососудов в различных образцах опухоли.

Результаты

1,25 (OH)2D3 ингибирует VEGF-индуцированную пролиферацию эндотелиальных клеток

Определяли уровни 1,25(OH)2D3 добавленного в культивируемые БЭКА в присутствии фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), а также воздействие этих факторов на пролиферацию клеток.

VEGF стимулирует пролиферацию эндотелиальных клеток (Р<0,01) (Рис. 1 и онлайн-таблица 1, доступные по адресу http://www.circresaha.org). 1,25 (OH)2D3 ингибировал VEGF-индуцированную пролиферацию эндотелиальных клеток, и это ингибирование было дозозависимым [Р<0,05 при 1×10-7 моль/л 1,25 (OH)2D3] (Рис. 1 и онлайн-таблица 1, доступные по адресу http://www.circresaha.org). Конечное количество клеток в культурах, инкубированных с VEGF и 1×10-7 моль/л 1,25 (OH)2D3, было эквивалентно таковым, инкубированным в контрольной среде (Рис.1).

1,25 (OH)2D3 ингибирует ангиогенез In Vitro

Чтобы определить влияние 1,25 (OH)2D3 на ранние стадии ангиогенеза, индуцированного фактором роста in vitro, VEGF добавляли к слиянию БЭКА в присутствии и отсутствии 1,25(OH) 2D3, а образование удлиненных прорастающих эндотелиальных клеток исследовали и количественно определяли с помощью анализа изображений (Рис.2 и 3). Контрольные эндотелиальные клетки оставались в виде монослоев полигональных клеток, характерных для «покоящегося» фенотипа эндотелиальных клеток (рис. 2А). По мере развития эксперимента в контрольных культурах появлялось небольшое количество одиночных, удлиненных, прорастающих клеток; однако эти клетки оставались изолированными и немногочисленными. VEGF индуцировал образование прорастающих удлиненных клеток под монослоем клеток, которые объединялись, образуя сети взаимосвязанных многоклеточных шнуров (рис. 2Б). Одновременное добавление 1,25 (OH)2D3 и VEGF значительно ингибировало морфогенетический эффект этого фактора роста дозозависимым образом [Р<0,05 при 1×10-9 моль/л 1,25(OH)2D3; Р<0,01 при 1×10-8-1×10-7 моль/л 1,25(OH) 2D3] (Рис.2 и 3). Несколько прорастающих клеток, которые присутствовали, были менее вытянутыми, чем те, которые образовались в отсутствие 1,25 (OH) 2D3, и эти клетки оставались изолированными и не объединялись в сети (рис.2С). Добавление 1,25 (OH) 2D3 (1×10-7 моль/л) само по себе ингибировало образование проростков эндотелиальных клеток в контрольной среде (Р<0,01), но не оказывало влияния на морфологию клеток, присутствующих в монослое (Рис.2 и 3).

Для дальнейшего изучения влияния 1,25 (OH)2D3 на морфогенез эндотелиальных клеток клетки были покрыты коллагеновыми гелями. В этих условиях эндотелиальные клетки удлиняются, мигрируют и самоассоциируются в трубчатые структуры в отсутствие клеточной пролиферации (13). Контрольные БЭКА, покрытых коллагеновыми гелями, приняли удлиненную морфологию и ассоциировались друг с другом, образуя сети клеток (рис.4А). Напротив, клетки, культивированные в присутствии 1,25 (OH) 2D3, оставались округлыми (рис.4Б).

1,25 (OH)2D3 индуцирует регрессию существующих прорастающих эндотелиальных клеток

Исследовано влияние 1,25(OH)2D3 на уже существующие удлиненные прорастающие клетки. Сливающиеся клетки эндотелия были вынуждены пробиваться в присутствии фактора роста эндотелия сосудов(VEGF). Затем культуры инкубировали в присутствии или отсутствии 1,25 (OH) 2D3 без фактора роста. В контрольных культурах сети удлиненных прорастающих клеток все еще присутствовали через 6 дней после отмены VEGF (рис.5А). Инкубация клеток с 1,25 (OH) 2D3 приводила к дозозависимому регрессу прорастающих клеток. Кроме того, прорастающие клетки, присутствующие в этих культурах, были менее удлиненными и сильно вакуолизированными по сравнению с контрольными культурами (рис.5Б).

Также было исследовано влияние 1,25 (OH)2D3 на морфогенез эндотелиальных клеток в коллагеновых гелях. Добавление 1,25 (OH) 2D3 привело к регрессии удлиненных прорастающих клеток в округлые клетки (рис.5D). Напротив, контрольные клетки оставались удлиненными (рис. 5С).

1,25 (OH)2D3 специфически индуцирует апоптоз прорастающих эндотелиальных клеток

Индукцию апоптоза 1,25 (OH)2D3 исследовали 3 методами. Во–первых, разрывы цепей ДНК были обнаружены с помощью анализа гибели клеток in situ, терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы-опосредованной dUTP nick end-labeling (TUNEL) (рис.6А-6С). В контрольных культурах наблюдалась ограниченная регрессия прорастающих клеток. Ядра прорастающих эндотелиальных клеток были в целом отрицательны на фрагментацию ДНК, о чем свидетельствует низкое окрашивание TUNEL (рис.6А). Добавление 1,25 (OH) 2D3 (1×10-7 моль/л) к VEGF-стимулированным культурам приводило к большому количеству ядер, которые были положительны для фрагментации ДНК. Окрашенные ядра были специфически связаны с популяцией прорастающих эндотелиальных клеток; в монослое булыжника окрашивания не наблюдалось (рис. 6Б и 6С). Во-вторых, исследование целостности ДНК, выделенной из клеток, культивируемых в присутствии 1,25 (OH) 2D3, продемонстрировало наличие в этих образцах ДНК - лестницы, указывающей на межнуклеосомальное расщепление до целых чисел 180-200 БП (рис.6D). В-третьих, оценивали ядерную морфологию клеток, инкубированных в присутствии или отсутствии 1,25(OH)2D3 (рис.6E и 6F). Гомогенные популяции прорастающих клеток были получены путем нанесения покрытия на клетки внутри коллагеновых гелей. Клетки, инкубированные в присутствии или отсутствии 1,25 (OH)2D3, собирали (13) и окрашивали акридиновым оранжевым. Определяли количество апоптотических клеток, оцениваемое по наличию конденсации хроматина и фрагментации ядер (рис. 6F), и результаты выражали в процентах от общего числа присутствующих клеток. Клетки, инкубированные с 1,25 (OH) 2D3, имели значительно больше апоптотических ядер (12,0%), чем контрольные клетки (3,75%) (z=4,34, Р<0,0001).

1,25 (OH)2D3 ингибирует ангиогенез In Vivo

Влияние 1,25 (OH) 2D3 на формирование микрососудов in vivo было исследовано с использованием модели, в которой клетки рака молочной железы MCF-7, индуцированные к сверхэкспрессии VEGF121 (трансфектанты VEGF), были ксенотрансплантированы подкожно вместе с клетками рака молочной железы MDA-435S у мышей (16).

Опухоли образовались у всех мышей, которым вводили трансфектанты VEGF. Иммуногистохимия с использованием крысиного анти-CD31 антитела была использована для оценки васкулярности опухолей, продуцируемых у этих мышей. Скопления мелких капилляров присутствовали во всех опухолях (рис. 7). Однако лечение 1,25 (OH) 2D3 приводило к образованию опухолей, которые казались менее васкуляризованными, чем опухоли, сформированные у мышей, получавших только индифферентный раствор (Р=0,079, рис.8) (сравните рисунки 7А и 7B с рисунками 7С и 7D). Кроме того, большие капилляры были заметны в опухолях, сформированных у контрольных животных (рис. 7е и 7F); они никогда не наблюдались в опухолях, образовавшихся после лечения 1,25 (OH) 2D3. Объем опухоли существенно не изменялся, и доля клеток MCF7 и MDA-435S, присутствующих в опухолях, не отличалась у мышей, получавших 1,25(OH)2D3, по сравнению с теми, кто получал только эталонный раствор (контроль) (оцененный как описано, (16) результаты не показаны).

Обсуждение

Мы показали, что 1,25 (OH) 2D3 обладает антиангиогенными свойствами in vivo и in vitro, которые опосредуются прямым воздействием на “активированные” эндотелиальные клетки. Во-первых, используя модельные системы in vitro, мы продемонстрировали, что 1,25(OH)2D3 (от 1×10-9 до 1×10-7 моль/л) заметно ингибирует прорастание и морфогенез эндотелиальных клеток и оказывает небольшое, но значительное ингибирующее действие на VEGF-индуцированную пролиферацию эндотелиальных клеток. Во-вторых, мы показали, что 1,25(OH)2D3 индуцирует регрессию существующих проростков эндотелиальных клеток и удлиненных клеток и установили участие апоптоза в этом процессе. Наконец, мы продемонстрировали, что 1,25(OH)2D3 (в дозе 12,5 пмоль/сут), по-видимому, ингибирует образование новых кровеносных сосудов в опухолевых ксенотрансплантатах, индуцированных сверхэкспрессией VEGF. Ранее было показано, что эта доза, которая не вызывает гиперкальциемии у мышей, стимулирует транспорт кальция у мышей и имеет тот же порядок величины, что и терапевтическая доза замещения у людей.

Большинство исследований влияния 1,25 (OH)2D3 на рост и дифференцировку клеток сообщают об ингибировании пролиферации в сочетании с индукцией дифференцировки, причем реакции происходят в диапазоне концентраций от 1×10-9 до 1×10-7 моль/л. (19, 20). Однако реакция эндотелиальных клеток на 1,25(OH) 2D3 дала противоречивые результаты. Одно исследование показало, что 1,25(OH)2D3 ингибирует пролиферацию эндотелиальных клеток, индуцированную сывороткой крови (8). Напротив, другие исследования показали, что 1,25(OH)2D3 не оказывает никакого влияния на индуцированный сывороткой рост эндотелиальных клеток, что согласуется с нашими данными. Теперь мы расширили эти исследования и продемонстрировали, что 1,25(OH)2D3 вызывает небольшое, но значительное ингибирование пролиферации эндотелиальных клеток, индуцированное VEGF, и что это ингибирование зависит от дозы.

Наиболее выраженное влияние на эндотелиальные клетки оказывали индукция (и поддержание) фенотипа удлиненного прорастания в этих клетках и последующая ассоциация этих удлиненных клеток в сети. Прорастание и морфогенез эндотелиальных клеток имеют фундаментальное значение для ангиогенного процесса (3). Эндотелиальные клетки, содержащиеся в развивающихся сосудистых почках, образуют сосудистые ростки in vivo, претерпевая морфогенные изменения, включающие расширение клеток и образование удлиненных проекций. Мы демонстрируем, что одновременное добавление 1,25 (OH)2D3 и VEGF к слиянию эндотелиальных клеток приводит к дозозависимому ингибированию прорастания, индуцированного при добавлении только VEGF. При добавлении 1,25(OH)2D3 к культивируемым клеткам не наблюдалось нарушения монослоя эндотелиальных клеток. Чтобы исследовать влияние 1,25 (OH) 2D3 на удлинение эндотелиальных клеток и их ассоциацию в сети при отсутствии какого-либо влияния на пролиферацию, клетки были покрыты коллагеновыми гелями (13). Используя эту модельную систему, мы подтвердили, что как прорастание, так и удлинение клеток, а также их объединение в сети ингибируются 1,25(OH)2D3.

Ингибирование выброса эндотелиальных клеток и морфогенеза 1,25 (OH)2D3 согласуется с антиангиогенным эффектом 1,25(OH) 2D3, о котором сообщалось при использовании хориоаллантоевой мембраны цыплят (12) использование модельных систем in vitro в настоящем исследовании расширило это последнее исследование, чтобы установить прямое влияние 1,25 (OH) 2D3 на эндотелиальные клетки. Lansink et al (11) недавно продемонстрировали, что высокие концентрации 1,25(OH)2D3 (от 1×10-5 до 1×10-6 моль/л) мало влияют на формирование капиллярных трубчатых структур дермальными микрососудистыми эндотелиальными клетками человека, культивируемыми на фибриновых матрицах в присутствии основного фактора роста фибробластов и фактора некроза опухоли-α. Эти, казалось бы, расходящиеся результаты могут быть объяснены различиями в природе модельной системы (фибрин против коллагена), используемых стимулирующих факторах (VEGF против основного фактора роста фибробластов и фактора некроза опухоли-α) и концентрациях тестируемого 1,25(OH)2D3. Однако следует отметить, что 1,25(OH)2D3 (от 1×10-9 до 1×10-7 моль/л) ингибирует образование удлиненных прорастающих клеток в культурах БЭКА, стимулированных фактором роста гепатоцитов (D. J. Mantell, A. E. Canfield, неопубликованные данные, 2000).

Ингибирующее действие 1,25 (OH) 2D3 на стимулируемую фактором роста пролиферацию и морфогенез можно объяснить с помощью ряда механизмов. Во-первых, факторы роста могут модулировать экспрессию ядерного рецептора витамина D (21). Во-вторых, 1,25 (OH) 2D3 может регулировать продукцию фосфолипазы с клетками (22), которая, в свою очередь, может модулировать передачу сигнала рецепторами с активностью тирозинкиназы, включая VEGF-R1 и VEGF-R2. Наконец, 1,25 (OH) 2D3 может модулировать экспрессию рецепторов фактора роста (23). Однако было показано, что 1,25(OH)2D3 не оказывает никакого влияния на экспрессию генов рецепторов VEGF эндотелиальными клетками (10), предполагая, что ингибирование VEGF-индуцированной пролиферации эндотелиальных клеток, наблюдаемое в настоящем исследовании, не связано с понижением регуляции рецепторов VEGF 1,25(OH)2D3.

Важно отметить, что мы демонстрируем, что 1,25 (OH) 2D3 также индуцирует регрессию удлиненных прорастающих клеток in vitro, индуцируя апоптоз именно в этой клеточной популяции. 1,25 (OH) 2D3 индуцирует апоптоз раковых клеточных линий in vitro24 и in vivo (25). Предыдущие исследования показали, что 1,25(OH)2D3 повышает уровень кластерина и катепсина (24). Кроме того, 1,25(OH)2D3 понижает уровень антиапоптотического белка bcl-2, одновременно повышая экспрессию р53, что приводит к активной гибели клеток (26). VEGF предотвращает апоптоз в культивируемых эндотелиальных клетках, индуцируя экспрессию антиапоптотических белков Bcl-2 и A1 (27). Поэтому особый интерес будет представлять определение влияния 1,25 (OH) 2D3 на экспрессию антиапоптотических и проапоптотических белков эндотелиальными клетками.

Индукция апоптоза раковых клеток in vivo была предложена в качестве механизма регрессии опухолей, наблюдаемой при введении аналогов 1,25(OH)2D3 (25). Однако демонстрация в настоящем исследовании, которая просто не соответствует статистической значимости, то, что низкие дозы 1,25(OH)2D3, по-видимому, ингибируют образование новых кровеносных сосудов в модели in vivo индуцированного VEGF опухолевого ангиогенеза (Р=0,079), предполагает, что регрессия сосудистого снабжения путем индукции апоптоза в стимулированных фактором роста эндотелиальных клетках может быть еще одним механизмом, с помощью которого 1,25(OH)2D3 вызывает регрессию опухоли. Кроме того, большие капилляры никогда не наблюдались в опухолях, образовавшихся после лечения 1,25(OH)2D3, что позволяет предположить, что 1,25(OH)2D3 также может ингибировать рост и созревание сосудов. Тот факт, что мы не обнаружили каких-либо различий в объемах опухоли, может отражать либо низкую дозу 1,25(OH)2D3, продолжительность экспериментов и/или количество использованных животных. Использование высоких доз 1,25 (OH)2D3 было избегнуто из-за риска индуцирования гиперкальциемии у мышей. Но открытие того, что даже эта низкая доза 1,25(OH)2D3 (которая находится в пределах нормы) ингибирует VEGF-индуцированный ангиогенез in vivo, повышает вероятность того, что аналоги 1,25(OH)2D3 с меньшим кальцемическим эффектом могут быть использованы еще более успешно в этой модели. Кроме того, эти данные согласуются с нашим клиническим исследованием, показывающим, что уровень 1,25(OH)2D3 в сыворотке крови обратно связан с прогрессированием заболевания у пациентов с метастатическим раком молочной железы (28).

Таким образом, мы демонстрируем, что 1,25(OH)2D3 ингибирует специфические стадии ангиогенного процесса. Прямые эффекты 1,25(ОН)2D3 на пролиферацию эндотелиальных клеток и морфогенеза наблюдается с использованием этих модельных систем в лабораторных условиях предоставления доказательств в соответствии с антиангиогенными эффектами 1,25(ОН)2D3 показанными в естественных условиях. Кроме того, индукция апоптоза именно в активированной, ангиогенной популяции эндотелиальных клеток предполагает, что это может быть механизмом, лежащим в основе наблюдаемых антиангиогенных эффектов 1,25(OH)2D3. Эти результаты позволяют предположить, что 1,25 (OH) 2D3 (или аналоги этого гормона) могут быть использованы для профилактики состояний, связанных с патологическим ангиогенезом, а также могут быть использованы в терапевтической регрессии таких состояний, характеризующихся аберрантным ангиогенезом.

Запросы на перепечатку адресованы доктору А. Э. Кэнфилду, Wellcome Trust Centre for Cell Matrix Research, Department of Medicine, University of Manchester, 2.205 Stopford Building, Oxford Road, Manchester M13 9PT, UK.

---

Литература

1. Folkman J. Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other diseases. Nat Med. 1995;1:27–31. Crossref. PubMed.
2. Pepper MS. Manipulating angiogenesis: from basic science to the bedside. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 1997;17:605–619. Crossref. PubMed.
3. Diaz-Flores L, Gutierrez R, Varela H. Angiogenesis: an update. Histol Histopathol. 1994;9:807–843. PubMed.
4. Ferrara N, Davis-Smyth T. The biology of vascular endothelial growth factor. Endocr Rev. 1997;18:4–25. Crossref. PubMed.
5. Neufeld G, Cohen T, Genrinovitch S, Poltorak Z. Vascular endothelial growth factor (VEGF) and its receptors. FASEB J. 1999;13:9–22. Crossref. PubMed.
6. Benjamin LE, Golijanin D, Itin A, Pode D, Keshet E. Selective ablation of immature blood vessels in established human tumours follows vascular endothelial growth factor withdrawal. J Clin Invest. 1999;103:159–165. Crossref. PubMed.
7. Gerber HP, Hillan KJ, Ryan AM, Kolawski J, Keller GA, Rangell L, Wright BD, Radtke F, Aguet M, Ferarra N. VEGF is required for growth and survival in neonatal mice. Development. 1999;126:1149–1159. PubMed.
8. Merke J, Milde P, Lewicka S, Hugel U, Klaus G, Mangelsdorf DJ, Haussler MR, Rauterberg EW, Ritz EJ. Identification and regulation of 1,25-dihydroxyvitamin D3 receptor activity and biosynthesis of 1,25-dihydroxyvitamin D3: studies in cultured bovine aortic endothelial cells and human dermal capillaries. J Clin Invest. 1989;83:1903–1915. Crossref. PubMed.
9. Hisa T, Taniguchi S, Tsuruta D, Hirachi Y, Ishizuka S, Takigawa M. Vitamin D inhibits endothelial cell migration. Arch Dermatol Res. 1996;288:262–263. Crossref. PubMed.
10. Wang DS, Miura M, Demura H, Sato K. Anabolic effects of 1,25-dihydroxyvitamin D3 on osteoblasts are enhanced by vascular endothelial growth factor produced by osteoblasts and by growth factors produced by endothelial cells. Endocrinology. 1997;138:2953–2962. Crossref. PubMed.
11. Lansink M, Koolwijk P, Hinsbergh V, Kooistra T. Effect of steroid hormones and retinoids on the formation of capillary-like tubular structures of human microvascular endothelial cells in fibrin matrices is related to urokinase expression. Blood. 1998;92:927–938. PubMed.
12. Oikawa T, Hirotani O, Katayama T, Nakamura O, Iwaguchi I, Hiragun A. Inhibition of angiogenesis by vitamin D3 analogues. Eur J Pharmacol. 1990;178:247–250. Crossref. PubMed.
13. Schor AM, Schor SL, Allen TD. Effects of culture conditions on the proliferation, morphology and migration of bovine aortic endothelial cells. J Cell Sci. 1983;62:267–285. PubMed.
14. Folkman J, Haudenschild C. Angiogenesis in vitro. Nature. 1980;288:551–553. Crossref. PubMed.
15. Iruela-Arispe ML, Hasselaar P, Sage EH. Differential expression of extracellular proteins is correlated with angiogenesis in vitro. Lab Invest. 1991;64:174–186. PubMed.
16. Zhang H-T, Craft P, Scott PAE, Ziche M, Weich HA, Harris AL, Bicknell R. Enhancement of tumour growth and vascular density by transfection of vascular endothelial growth factor into MCF-7 human breast carcinoma cells. J Natl Cancer Inst. 1995;87:213–219. Crossref. PubMed.
17. Freeth JS, Ayling RM, Whatmore AJ, Towner P, Price DA, Norman MR, Clayton PE. Human skin fibroblasts as a model of growth hormone (GH) action in GH receptor-positive Laron’s syndrome. Endocrinology. 1987;138:55–61.
18. Pullan S, Wilson J, Metcalfe A, Edwards GM, Goberdhan N, Tilly J, Hickman JA, Dive C, Streuli CH. Requirement of basement membrane for the suppression of programmed cell death in mammary epithelium. J Cell Sci. 1996;109:631–642. PubMed.
19. Walters MR. Newly identified actions of the vitamin D endocrine system. Endocr Rev. 1992;13:719–764. PubMed.
20. Stern PH. 1,25 Dihydroxyvitamin D3 interactions with local factors in bone remodelling. In: Feldman D, Glorieux FH, Pike JW, eds. Vitamin D. San Diego, Calif: Academic Press; 1997:341–352.
21. Haussler MR, Whitfield GK, Haussler CA, Hsieh JC, Thompson PD, Selznick SH, Dominguez CE, Jurutka PW. The nuclear vitamin D receptor: biological and molecular regulatory properties revealed. J Bone Miner Res. 1998;13:325–349. Crossref. PubMed.
22. Swain LD, Schwartz Z, Boyan BD. 1,25-(OH)2D3 and 24,25-(OH)2D3 regulation of arachidonic acid turnover in chondrocyte cultures is cell maturation specific and may involve direct effects of phospholipase A2. Biochem Biophys Acta. 1992;1136:45–51. Crossref. PubMed.
23. Koga M, Eisman JA, Sutherland RL. Regulation of epidermal growth factor receptor levels by 1,25-dihydroxyvitamin D3 in human breast cancer cells. Cancer Res. 1988;48:2734–2739. PubMed.
24. Simboli-Campbell M, Narvaez CJ, Tenniswood M, Welsh J. 1,25-Dihydroxyvitamin D3 induces morphological and biochemical markers of apoptosis in MCF-7 breast cancer cells. J Steroid Biochem Mol Biol. 1996;58:367–376. Crossref. PubMed.
25. VanWeelden K, Flanagan L, Binderup L, Tenniswood M, Welsh J. Apoptotic regression of MCF-7 xenografts in nude mice treated with the vitamin D3 analogue, EB 1089. Endocrinology. 1998;139:2102–2110. Crossref. PubMed.
26. James SY, Mackay AG, Colston KW. Effects of 1,25-dihydroxyvitamin D3 and its analogues on induction of apoptosis in breast cancer cells. J Steroid Biochem Mol Biol. 1996;58:395–401. Crossref. PubMed.
27. Gerber H-P, Dixit V, Ferrara N. Vascular endothelial growth factor induces expression of the antiapoptotic proteins Bcl-2 and A1 in vascular endothelial cells. J Biol Chem. 1998;273:13313–13316. Crossref. PubMed.
28. Mawer EB, Walls J, Howell A, Davies M, Ratcliffe WA, Bundred NJ. Serum 1,25 dihydroxyvitamin D may be related inversely to disease activity in breast cancer patients with bone metastases. J Clin Endocrinol Metab. 1997;82:118–122. PubMed.