Взгляни на мироткрытыми глазами

Ресвератрол защищает эпителиальные клетки хрусталика человека от окислительного стресса, вызванного H2O2, путем увеличения экспрессии каталазы, SOD-1 и HO-1

Yi Zheng,1 Yaohua Liu,2 Jinying Ge,3 Xiaoyuan Wang,1 Lijuan Liu,1 Zhigao Bu3 and Ping Li1

Author information Article notes Copyright and License information

Абстракт

Цель

Окислительное повреждение, вызванное обработкой H2O2, может необратимо повредить эпителий хрусталика, что приводит к гибели клеток и катаракте. Можно ли ослабить влияние окислительного стресса в культивируемых эпителиальных клетках хрусталика человека путем инкубации с ресвератролом (RES), пока неизвестно. В настоящем исследовании мы исследовали функцию ресвератрола в защите эпителиальных клеток В-3 (HLEB-3) хрусталика человека от H2O2 -индуцированной гибели клеток и апоптоза клеток, его роль в уменьшении H2O2 -индуцированных внутриклеточных реактивных форм кислорода (ROS) накопления, и исследовали механизм, с помощью которого ресвератрол лежит в основе эффекта.

Методы

Клетки HLEB-3, линия эпителиальных клеток хрусталика человека, подвергали воздействию 100 мкМ H2O2 с предварительной обработкой RES или без нее в различных концентрациях в течение различного времени. Жизнеспособность клеток контролировали с помощью анализа 4- [3- [4-йодфенил] -2-4 (4-нитрофенил) -2Н-5-тетразолио-1,3-бензолдисульфоната] (WST-1). Скорость апоптоза и генерация АФК были определены методом проточной цитометрии. Уровни экспрессии белков супероксиддисмутазы-1 (SOD-1), каталазы и гем-оксигеназы-1 (HO-1) измеряли с помощью вестерн-блоттинга. Активацию p38 и c-jun N-концевой киназы (JNK) также оценивали с помощью вестерн-блоттинга.

Результаты

Ресвератрол явно уменьшал вызванный H2O2 апоптоз клеток и накопление АФК; защищали клетки HLEB-3 от H2O2, вызывающие окислительное повреждение, и повышали уровни экспрессии SOD-1, каталазы и HO-1. Дальнейшие исследования показали, что RES также ингибирует H2O2- индуцированное фосфорилирование р38 и JNK.

Выводы

Эти данные свидетельствуют о том, что RES защищает клетки HLEB-3 от H2O2 , вызывающего окислительное повреждение, предположительно, путем индукции трех антиоксидантных ферментов, включая каталазу, SOD-1 и HO-1.

Введение

Существуют убедительные доказательства того, что окислительное повреждение играет важную роль в возникновении и развитии многих возрастных заболеваний, таких как болезни Альцгеймера и Паркинсона, возрастная дегенерация желтого пятна и возрастная катаракта [ 1 ]. Прозрачная глазная линза особенно чувствительна к окислительным повреждениям, потому что клетчатка линзы не обновляется и должна сохраняться в течение всей жизни. Повреждение этих клеток приводит к деградации белка и, в конечном итоге, к возрастной катаракте. Таким образом, хрусталик глаза разработал широкий спектр защитных и восстановительных систем для защиты от окислительного стресса, включая высокие уровни восстановленного глутатиона (GSH) [ 2 ] и обильные антиоксидантные ферменты, такие как супероксиддисмутаза-1 (SOD-1) и каталаза [ 3]. Старение хрусталика характеризуется снижением уровня этих систем [ 2 , 3 ], потеря которых является основной причиной образования катаракты [ 4 , 5 ]. Несколько эпидемиологических наблюдений показали, что острые активные формы кислорода (АФК), вызванные обработкой H2O2, могут необратимо повредить эпителий хрусталика, что приводит к гибели клеток и катаракте [ 6 ]. Искусственное нацеливание каталазы на митохондрии задерживает образование катаракты у мышей [ 7 ], что свидетельствует о том, что продувка митохондриальной H2O2имеет важное значение для поддержания хрусталика и задержки формирования катаракты. Поэтому поиск стратегий для защиты эпителиальных клеток хрусталика от цитотоксичности, вызванной окислительным стрессом, является важной задачей.

В последние годы большое внимание уделялось натуральным диетическим антиоксидантам, особенно полифенолам, которые важны для противодействия окислительному стрессу [ 8 , 9 ]. Ресвератрол (3, 5, 4'-тригидроксистилбен; RES) представляет собой полифенольное природное соединение фитоалексина, встречающееся в некоторых растениях, включая виноград, арахис и другие продукты. Это оказалось критическим вопросом с антиоксидантными функциями in vitro и на моделях клеточных культур [ 10 ]. Ungvari и соавт. [ 11 ] обнаружили, что обработка RES усиливает экспрессию глутатионпероксидазы, каталазы и гемоксигеназы-1 (HO-1) в культивируемых артериях и, по-видимому, повышает устойчивость сосудистого окислительного стресса путем очистки от H2O2 и предотвращение эндотелиальных клеток от смерти клеток, вызванной окислительным стрессом. Кing и соавт. [ 12 ], исследование показало, что RES значительно уменьшал базальное и H2O2 -индуцированное накопление внутриклеточных ROS, поэтому уменьшало потребность клеток ретинального пигментного эпителия (RPE) вызывать индуцированный окислителем ответ на выживание, затем уменьшал H2O2 -индуцированную регулируемую внеклеточным сигналом киназу (ERK 1 / 2 ) активация в эпителиальных клетках сетчатки (RPE). Хотя наблюдения продемонстрировали широкую антиоксидантную активность RES и показали, что он был эффективным поглотителем АФК [ 13 - 16 ], играет ли он какую-то роль в предотвращении H2 O2 индуцировали окислительный стресс в эпителиальных клетках хрусталика человека, и механизмы этого эффекта не были документированы.

В настоящем исследовании мы впервые изучили, может ли ресвератрол снижать апоптоз клеток, индуцированный H2O2 , и гибель клеток в культивируемых эпителиальных клетках B-3 (HLEB-3) хрусталика человека; затем мы обнаружили, может ли RES поглотить накопление внутриклеточных ROS; наконец, мы исследовали механизм RES в защите клеток HLEB-3 от окислительного повреждения.

Методы

Материалы

Клетки HLEB-3 (эпителиальные клетки В3 человека хрусталика) были получены от АТСС (Rockville, MD). Фетальная бычья сыворотка (FBS) и модифицированная по Дульбекко среда Игла (DMEM) были получены от Gibco (Grand Island, NY). Пропидий йодид (PI) и аннексин-V были получены от Becton Dickinson (Mountain View, CA). Ресвератрол был от Sigma Chemical Co. (Сент-Луис, Миссури). Анти-JNK, анти-фосфорилирование JNK (p-JNK), анти-фосфорилирование P38 (p-p38) (Thr180 / Tyr182), анти-p38, анти-каталаза, анти-SOD-1 и анти-HO- 1 антитело было приобретено у Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA).

Культура клеток

Клетки HLEB-3 культивировали в DMEM с добавлением инактивированной нагреванием (56 ° C, 0,5 ч) 15% FBS при 37 ° C в увлажненной атмосфере с 5% CO2 . Клетки высевали в 60 мм культуральную чашку (Falcon; Becton Dickinson). При выращивании до слияния 75–80% клетки обрабатывали указанной концентрацией H2O2 в течение требуемого времени или предварительно обрабатывали RES в течение другого времени перед обработкой H2O2 . В указанные моменты времени клетки собирали для различных анализов.

Анализ жизнеспособности клеток

Пролиферацию клеток HLEB-3 оценивали с использованием сульфонированной тетразолиевой соли WST-1 (4- [3- [4-йодфенил] -2–4 (4-нитрофенил) -2H-5-тетразолио-1,3-бензол дисульфонкислый]). Измерение основано на способности жизнеспособных клеток расщеплять соли тетразолия с помощью митохондриальных дегидрогеназ. Вкратце, клетки HLEB-3 высевали с плотностью 1 × 10 4 клеток / лунку в 96-луночные микропланшеты, в DMEM, содержащую 15% FBS, и инкубировали при 37 ° C в увлажненной атмосфере с 5% CO2 . После 24-часовой инкубации при приблизительно 70% слиянии клетки предварительно обрабатывали RES, 2,5, 5,0, 10,0 и 20,0 мкМ в течение 12, 24 и 48 часов. После инкубации в течение указанного времени клетки обрабатывали 50, 100 и 200 мкМ H2O2.в комбинации в течение 24 часов. Для анализа жизнеспособности клеток добавляли 10 мкл / лунку реагента WST-1 и инкубировали в течение 2 ч при 37 ° С и 5% СО 2 . Для клеток HLEB-3 поглощение образцов измеряли при 450 нм с использованием считывателя микропланшетов с контролем фона в качестве бланка. Коэффициент выживаемости клеток выражали в процентах от контроля.

Проточный цитометрический анализ с использованием аннексина V и йодида пропидия (PI)

Клетки выращивали на 6-луночном планшете при 1 × 10 5 клеток на планшет и предварительно обрабатывали с или без различной концентрации RES в течение 12 часов перед обработкой 100 мкМ H2O2 в течение 24 часов. Клетки центрифугировали для удаления среды, промывали холодным 1 × PBS и окрашивали аннексином V-FITC и PI в буфере для связывания (10 мМ Hepes, 140 мМ NaCl и 2,5 мМ CaCl 2 ). Десять тысяч событий были собраны для каждого образца. Окрашенные клетки анализировали с использованием программного обеспечения Cell-Quest в каналах FL1-H и FL2-H.

Обнаружение ROS

Производство активных форм кислорода (АФК) контролировали с помощью проточной цитометрии. Клетки инкубировали с 10,0 мкМ 5- (и-6) -карбокси-20, 70-дихлордигидрофлуоресцеина диацетата (карбокси-H2DCFDA) C-400 (Molecular Probes, Eugene, OR) в течение 30 минут. Затем их промывали и инкубировали с полной средой в течение 2 часов. Генерацию ROS определяли с использованием проточной цитометрии FAC Scan с использованием программного обеспечения Cell-Quest (Becton Dickinson), и флуоресцентные сигналы отображали в виде гистограмм.

Вестерн-блоттинг

После промывания ледяным PBS клетки лизировали путем добавления 200 мкл буфера RIPA (100 мМ NaCl, 2 мМ EDTA, 1 мМ PMSF, 1% NP-40 и 50 мМ трис-HCl [pH 7,2]). Клеточные лизаты собирали и концентрацию белка в них оценивали с использованием анализа белка (Bio-Rad, Melville, NY). Лизаты (20 мкг на линию) разделяли с помощью 10% -15% гелей SDS-PAGE и затем переносили в поливинилидендифторид. (PVDF) мембраны (Millipore, Bedford, MA) при 20 В в течение 50 мин. Мембраны замачивали в 5% BSA (Sigma) в течение ночи. Мембраны инкубировали с первичными антителами в течение ночи при 4 ° С, а затем инкубировали с соответствующими вторичными антителами, связанными с пероксидазой (Amersham, Santa Cruz, CA), в течение 1 часа при комнатной температуре. Сигналы были разработаны стандартным усиленным методом хемилюминесценции в соответствии с протоколом производителя (Amersham).

Статистический анализ

Статистический анализ оценивали с использованием t- критерия Стьюдента (программа SPSS, версия 10.1; SPSS, Сан-Рафаэль, Калифорния). Р <0,05 считалось статистически значимым.

Результаты

Влияние резвератрола на защиту от H2O2 -индуцированной гибели клеток и апоптоза в клетках HLEB-3

Чтобы выяснить, обеспечивает ли RES защиту от повреждения клеток, вызванного H2O2 , в клетках HLEB-3, мы обнаружили жизнеспособность клеток HLEB-3 после 100 мкМ H2O2 в течение 24 часов с предварительной обработкой RES или без нее в нескольких концентрациях. (2,5, 5,0, 10,0 и 20,0 мкм) в течение 12 часов. Результаты показали, что предварительная обработка с помощью RES предотвратила 100 мкМ H2O2, вызванную потерей жизнеспособности клеток дозозависимым образом, как показано на Рис. 1А . Таким образом, 20 мкМ была определена как оптимальная доза для предварительной обработки RES. Затем мы исследовали, было ли время инкубации RES иметь какое-либо различие в защитном эффекте против H2O2вызванная гибель клеток. Анализ WST-1 показал, что предварительная обработка RES в течение 12 часов была оптимальным временем по сравнению с другими, как показано на рисунке 1B . Затем мы выбрали 12-часовую предварительную обработку с 20,0 мкМ RES до воздействия различных концентраций H2O2 и обнаружили, что защитный эффект RES был пропорционален уровням H2O2, как показано на Рис. 1C . Взятые вместе, эти результаты показали, что RES играет защитную роль против индуцированного H2O2 повреждения клеток в зависимости от дозы, и оптимальное время инкубации для предварительной обработки RES составляет 12 часов.

Рис. 1 Ресвератрол защищает от H2O2 -индуцированной гибели клеток и апоптоза в клетках HLEB-3. A : Клетки HLEB-3 инкубировали с различными концентрациями RES (2,5, 5,0, 10,0 и 20,0 мкМ) в течение 12 часов перед обработкой H2O2 (100 мкМ) в течение 24 часов. Б. Клетки инкубировали с 20,0 мкМ RES в течение различного времени (12, 24, 48 ч), затем обрабатывали 100 мкМ H2O2 в течение 24 ч. C : клетки предварительно обрабатывали 20,0 мкМ RES в течение 12 часов, затем подвергали воздействию различной концентрации H2O2(50, 100, 200 мкМ) в течение 24 ч, жизнеспособность клеток измеряли анализом WST-1. Данные представлены в виде среднего ± SD из трех независимых экспериментов. Звездочка указывает, что р <0,05 по сравнению с необработанным контролем. D : клетки инкубировали с 10,0 и 20,0 мкМ RES в течение 12 часов, затем обрабатывали 100 мкМ H2O2 в течение 24 часов. Проточный цитометрический анализ использовали для количественной оценки скорости клеточного апоптоза с использованием двойного окрашивания аннексина V-FITC и PI. Результатом является один репрезентативный пример трех отдельных экспериментов. E : Ресвератрол (20 мкМ) значительно снижал скорость апоптоза клеток HLEB-3, ** р <0,01 по сравнению с положительным контролем ( t- тест), превентивный эффект 20 мкМ RES был улучшен по сравнению с 10 мкМ RES, * р <0,05.

Чтобы проверить, защищает ли RES против H2O2 -индуцированного апоптоза, клетки HLEB-3 инкубировали с 10,0 мкМ и 20,0 мкМ RES в течение 12 часов, затем обрабатывали 100 мкМ H2O2 в течение 24 часов. Проточный цитометрический анализ использовали для количественной оценки скорости клеточного апоптоза с использованием двойного окрашивания аннексина V-FITC и PI. Значительный апоптоз наблюдался в клетках HLEB-3, обработанных 100 мкМ H2O2, в то время как предварительная обработка RES при 10,0 мкМ и 20,0 мкМ явно снижала апоптоз, индуцированный H2O2 ( Рис. 1D ). Три повторных эксперимента показали, что предварительная обработка RES в зависимости от дозы снижает степень апоптоза, вызванную H2 O2 , который был статистически значимым ( Рис. 1E ).

Ресвератрол уменьшал образование активных форм кислорода (АФК), индуцированных H2O2 в клетках HLEB-3

АФК, индуцированную H2O2, исследовали путем измерения уровня продукции АФК с использованием DCF-DA. Клетки HLEB-3, обработанные 100 мкМ H2O2 в течение 2 ч, приводили к выработке АФК с примерно двукратным увеличением по сравнению с необработанными клетками. Тем не менее, предварительная обработка клеток RES заметно снижала уровни ROS, генерируемые H2O2 в клетках HLEB-3 ( Рис. 2A ). Три повторных эксперимента показали, что предварительная обработка RES в зависимости от дозы ингибировала генерацию АФК, индуцированную H2O2 , что имело статистическую значимость ( Рис. 2B ).

Рис. 2 Ресвератрол уменьшил поколение АФК. A : Клетки предварительно обрабатывали 10,0 и 20,0 мкМ RES в течение 12 часов, а затем обрабатывали 100 мкМ H2O2 в течение 2 часов. Продукцию АФК исследовали путем измерения уровня продукции АФК с использованием DCF-DA методом проточной цитометрии. Результатом является один репрезентативный пример трех отдельных экспериментов. B : Ресвератрол (20,0 мкМ) значительно снижал образование ROS в клетках HLEB-3 ** p <0,01 по сравнению с отрицательным контролем RES. Степень RES 20,0 мкМ была выше, чем 10,0 мкМ RES * p <0,05.

Ресвератрол повышал уровень экспрессии SOD-1, HO-1 и каталазы

Поскольку RES может значительно снижать уровни ROS и защищать от смерти клеток, вызванной H2O2 , мы предположили, что RES может индуцировать некоторые ферменты, которые могут защищать клетки от цитотоксичности, вызванной H2O2 . Мы оценили уровни экспрессии трех ферментов с помощью вестерн-блот-анализа в обработанных клетках HLEB-3, которые известны или считаются важными для защиты от окислительного стресса, включая супероксиддисмутазы (SOD), гемоксигеназу (HO-1) и каталазу. , Мы обнаружили уровни экспрессии этих белков через 6, 12, 24 и 48 ч после начальной обработки 20,0 мкМ RES. Мы обнаружили, что с течением времени уровни белка в предварительно обработанных клетках увеличивались по сравнению с контрольными клетками, особенно через 12 часов, как показано на рисунке 3А.показывает. В соответствии с этими результатами, анализ WST-1 показал, что предварительная обработка с RES в течение 12 часов была оптимальным временем по сравнению с другими. Затем мы исследовали уровни белка этих ферментов через 12 ч после предварительной обработки с помощью RES, 2,5, 5,0, 10,0 и 20,0 мкМ и обнаружили, что уровни экспрессии этих белков были пропорциональны концентрации RES, как показано на рисунке 3B . Эти результаты показали, что SOD-1, HO-1 и каталаза могут играть важную роль в защитном действии RES.

Рис. 3 Ресвератрол усиливал экспрессию SOD-1, HO-1 и каталазы. A : Вестерн-блоттинг-анализ SOD-1, HO-1 и каталазы в разные моменты времени (6, 12, 24 и 48 ч) после предварительной обработки 20,0 мкМ ресвератрола. B : Вестерн-блоттинг анализ SOD-1, HO-1 и каталазы через 12 ч после предварительной обработки с различной концентрацией резвератрола (2,5, 5,0, 10,0 и 20,0 мкМ). Уровни экспрессии RES-предварительно обработанных клеток значительно увеличились по сравнению с контрольными клетками (р <0,05), а уровни экспрессии были пропорциональны концентрации ресвератрола.

Ресвератрол ингибировал фосфорилирование р38 и JNK

Чтобы получить дополнительные доказательства защитного действия RES, мы изучили влияние RES на пути, потенциально активируемые во время апоптоза. Общепринято, что активация ERK важна для выживания клеток, тогда как считается, что активация JNK и p38 играет важную роль в гибели клеток [ 17 , 18 ]. Поэтому мы исследовали, были ли пути p38 и JNK ингибированы лечением RES. Клетки HLEB-3 обрабатывали 100 мкМ H2O2 с предварительной обработкой RES или без нее. Экстракты цельных клеток готовили и анализировали с использованием антител против активных фосфорилированных форм JNK и p38. Как показано на рисунке 4 , пик фосфорилирования JNK (MW 46 кДа) произошел через 1 ч после H2. Обработка O2 и активация поддерживались в течение 1-2 часов. После предварительной обработки RES, хотя H1 O2 -индуцированное фосфорилирование JNK происходило через 1 час, оно быстро исчезало и возвращалось в неактивирующую форму через 2 часа. Фосфорилирование р38 активировалось через 1 час и достигало пика через 2 часа и поддерживалось до 3 часов после обработки H2O2 . Однако после предварительной обработки с помощью RES время пика фосфорилирования p38 все еще наступало через 1 час, но уменьшалось и сохранялось только в течение 2 часов. Более того, предварительная обработка RES, уровни экспрессии p-p38 и p-JNK были снижены по сравнению с группой без предварительной обработки. Эти результаты показали, что предварительная обработка RES подавляла фосфорилирование JNK и p38.

Рис. 4 Ресвератрол ингибирует фосфорилирование р38 и JNK. Клетки HLEB-3 обрабатывали 100 мкМ H2O2 с 20,0 мкМ ресвератролом или без него в течение интервалов от 1 до 3 ч до p38, а активность JNK оценивали с помощью вестерн-блоттинга с использованием антифосфорилированных p38 и антифосфорилированных JNK-антител. Ресвератрол значительно ингибировал фосфорилирование р38 и JNK по сравнению с контролем. Анти-р38 и анти-JNK белковые антитела показывают одинаковую загрузку образцов белка.

Обсуждение

Наши результаты показывают, что RES фактически защищает клетки HLEB-3 от окислительного повреждения, вызванного H2O2 , и защитный механизм заключается в том, что RES индуцирует три фермента, которые, как считается, необходимы для защиты от окислительного стресса (SOD-1, HO-1 и каталаза). Несмотря на то, что несколько исследований показали, что RES может ослаблять процессы, связанные с катарактогенезом, а также ингибировать образование катаракты у грызунов [ 18 - 21 ], наш эксперимент является первым, чтобы показать его защитную функцию в эпителиальных клетках хрусталика человека и его механизм против окислительного стресса. , Таким образом, он имеет потенциальную терапевтическую роль в профилактике катаракты.

Wan-Cheng и соавт. [ 22 ] обнаружили, что пациенты с катарактой в возрасте от 12 до 94 лет имели апоптотические эпителиальные клетки в диапазоне от 4,4 до 41,8%. Напротив, в восьми нормальных человеческих линзах сопоставимого возраста было обнаружено очень мало апоптотических эпителиальных клеток. Этот результат показал, что этот единственный слой эпителиальных клеток хрусталика необходим для поддержания метаболического гомеостаза и прозрачности всей хрусталика [ 23].]. Если такие условия изменяются или нарушаются такими факторами, как окислительный стресс, жизнеспособность эпителиальных клеток хрусталика может быть поставлена под угрозу, что может привести к помутнению хрусталика. Кроме того, предыдущие исследования показали, что хроническое воздействие света и патогенная активность эпителиальных клеток хрусталика могут вызывать высокие локальные концентрации кислорода (АФК), которые богаты хрусталиком [ 24 ]. Окислительный стресс, вызванный АФК, был признан важным медиатором апоптоза в эпителиальных клетках хрусталика [ 6 , 25 , 26 ], который был идентифицирован как обеспечивающий важную молекулярную основу как для инициации, так и для развития катаракты [ 27 , 28]. Поэтому в нашем эксперименте H2O2 использовался в качестве окислительной модели классического окислительного стресса. Клетки, обработанные H2O2, показали повышенную продукцию внутриклеточных АФК и высокую скорость апоптоза. Однако предварительная обработка RES может значительно ингибировать продукцию ROS в клетках HLEB-3, обработанных H2O2 , что указывает на основную роль RES в защите от ROS. Кроме того, анализ проточной цитометрии с использованием PI и аннексина V показал, что H2O2индуцированный апоптоз клеток в клетках HLEB-3 был значительно снижен путем предварительной обработки RES. Эти результаты показали, что RES может не только снижать выработку ROS, но также предотвращать апоптоз клеток HLEB-3, вызванный H2O2 , что обеспечивает защитный эффект против повреждения клеток, вызванного H2O2 .

Предыдущие исследования показали, что нарушение баланса между продукцией АФК и продувкой часто приводит к апоптотической гибели клеток, что связано с образованием катаракты [ 6 , 29 - 33 ]. Поэтому было высказано предположение, что клеточная защита играет важную роль в защите эпителиальных клеток хрусталика от окислительного стресса и уменьшении прогрессирования различных типов катаракты [ 34 ]. Основываясь на результатах этого исследования, мы предположили, что RES может индуцировать некоторые ферменты в клетках HLEB-3, которые задерживают продуцирование активных радикалов кислорода, индуцированное H2O2 . Среди этих антиоксидантных ферментов каталаза, по-видимому, имеет решающее значение, поскольку она может удалять H2O2непосредственно. Кроме того, мы также обнаружили два других фермента, которые были необходимы для защиты от окислительного стресса, SOD-1 и HO-1. Предыдущие исследования показали, что ферментативная активность гемоксигеназы удаляла гем молекулы прооксиданта и генерировала поглотители свободных радикалов биливердин и билирубин, поэтому HO-1 обычно рассматривали как антиоксидант-индуцируемую клеточную защиту [ 35].]. Таким образом, мы обнаружили экспрессию этих трех ферментов с помощью вестерн-блот анализа; Результаты показали, что на уровне белка наблюдается увеличение экспрессии каталазы, SOD-1 и HO-1. Более того, индукция этих молекул была наибольшей после 12 ч инкубации с RES при 20 мкМ по сравнению с другими временными интервалами и концентрациями, что положительно коррелировало с защитными эффектами RES. Таким образом, указывается, что индукция каталазы, SOD1 и HO-1 участвует в механизме защитных эффектов RES.

В нескольких исследованиях сообщалось, что RES уменьшал пролиферацию различных клеток посредством ингибирования сигнального каскада ERK 1/2 и MAPK [ 36 - 41 ]. Общепризнанно, что активация ERK необходима для выживания клеток, тогда как считается, что активация JNK и p38 играет важную роль в передаче сигналов гибели клеток [ 17 , 42 ]. В настоящем исследовании, с целью дальнейшего доказательства защитного эффекта, предоставляемого RES против окислительного стресса, мы исследовали экспрессию двух основных сигнальных белков в путях MAPK. Наши данные показали, что H2O2индуцированная р38 и JNK активация была значительно снижена, когда клетки предварительно обрабатывали RES. Эти результаты позволяют предположить, что RES снижает накопление внутриклеточной АФК, вызванное H2O2 , снижает внутриклеточный окислительный уровень, косвенно предотвращает клетку HLEB-3 от p38 и сигнальный путь JNK индуцирует гибель клеток, а также доказывает, что RES играет важную роль в защите HLEB-. 3 клетки против окислительного стресса.

В заключение, настоящее исследование показало, что RES может значительно снизить индуцированное H2O2 внутриклеточное накопление ROS в эпителиальных клетках хрусталика человека и защитить клетки от апоптоза, индуцированного H2O2 . Кроме того, мы также показали, что RES снижает H2O2индуцированная активация p38 и JNK, косвенно предохраняет клетки HLEB-3 от p38, а путь передачи сигнала JNK индуцирует гибель клеток. Наши результаты показали, что один из основных механизмов может быть связан с повышением экспрессии каталазы, SOD-1 и HO-1 в клетках HLEB-3. Поэтому RES, как мощный антиоксидант и природное соединение, встречающееся в некоторых растениях, может использоваться в качестве потенциально полезного метода для профилактики катаракты. Дальнейшее выяснение молекулярного механизма RES, участвующего в клетках HLEB-3, может привести к разработке терапевтических стратегий для предотвращения и / или задержки катарактогенеза как у людей, так и у животных.

Подтверждения

Это исследование было поддержано грантом № 30973275-C170604 Национального фонда естественных наук, Китай. Мы благодарны доктору Чжиюан Вэнь, Донгмей Гонг и Национальной ключевой лаборатории ветеринарной биотехнологии / Харбинскому научно-исследовательскому институту ветеринарии Китайской академии сельскохозяйственных наук. Мы благодарим доктора Питера М. Олли за помощь в подготовке этой статьи.

Литература

  1. Beatty S, Koh H, Phil M, Henson D, Boulton M. The role of oxidative stress in the pathogenesis of age-related macular degeneration. Surv Ophthalmol. 2000;45:115–34. [PubMed] [Google Scholar]
  2. Giblin FJ, Boyle DL, Takemoto LJ, Ho YS, Knoernschild T. Juenemann,Glutathione: a vital lens antioxidant. J Ocul Pharmacol Ther. 2000;16:121–35. [PubMed] [Google Scholar]
  3. Phelps Brown N, Bron AJ. Lens disorders: a clinical manual of cataract diagnosis. Oxford: Butterworth-Heinemann; 1996. [Google Scholar]
  4. Brady JP, Garland D, Duglas-Tabor Y, Robison WG, Jr, Groome A, Wawrousek EF. Targeted disruption of the mouse alpha A-crystallin gene induces cataract and cytoplasmic inclusion bodies containing the small heat shock protein alpha B-crystallin. Proc Natl Acad Sci USA. 1997;94:884–9. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
  5. Reddy VN, Giblin FJ, Lin LR, Dang L, Unakar NJ, Musch DC. A, Lutjen-Drecoll E. Glutathione peroxidase-1 deficiency leads to increased nuclear light scattering, membrane damage, and cataract formation in gene-knockout mice. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2001;42:3247–55. [PubMed] [Google Scholar]
  6. Spector A. Oxidative stress-induced cataract: mechanism of action. FASEB J. 1995;9:1173–82. [PubMed] [Google Scholar]
  7. Wolf N, Penn P, Pendergrass W, Van Remmen H, Bartke A, Rabinovitch P, Martin GM. Age-related cataract progression in five mouse models for anti-oxidant protection or hormonal influence. Exp Eye Res. 2005;81:276–85. [PubMed] [Google Scholar]
  8. Manna C, Della Ragione F, Cucciolla V, Borriello A, D'Angelo S, Galletti P, Zappia V. Biological effectsof hydroxytyrosol, a polyphenol from olive oil endowed with antioxidant activity. Adv Exp Med Biol. 1999;472:115–30. [PubMed] [Google Scholar]
  9. Visioli F, Galli C. Biological properties of olive oil phytochemicals. Crit Rev Food Sci Nutr. 2002;42:209–221. [PubMed] [Google Scholar]
  10. Pervaiz S. Resveratrol: from grapevines to mammalian biology. FASEB J. 2003;17:1975–85. [PubMed] [Google Scholar]
  11. Ungvari Z, Orosz Z, Rivera A, Labinskyy N, Xiangmin Z, Olson S, Podlutsky A, Csiszar A. Resveratrol increases vascular oxidative stress resistance. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2007;292:H2417–24. [PubMed] [Google Scholar]
  12. King RE, Kent KD, Bomser JA. Resveratrol reduces oxidation and proliferation of human retinal pigment epithelial cells via extracellular signal-regulated kinase inhibition. Chem Biol Interact. 2005;151:143–9. [PubMed] [Google Scholar]
  13. Miura T, Muraoka S, Ikeda N, Watanbe M, Fujimoto Y. Antioxidative and prooxidative action of stilbene derivatives. Pharmacol Toxicol. 2000;86:203–8. [PubMed] [Google Scholar]
  14. Jang J-H, Surh Y-J. Protective effects of resveratrol on hydrogen peroxide-induced apoptosis in rat pheochromocytoma (PC12) cells. Mutat Res. 2001;496:181–90. [PubMed] [Google Scholar]
  15. Sparrow JR, Vollmer-Snarr HR, Zhou J, Jang YP, Jockusch S, Itagaki Y, Nakanishi K. A2E-epoxides damage DNA in retinal pigment epithelial cells. J Biol Chem. 2003;278:18207–13. [PubMed] [Google Scholar]
  16. Aziz MH, Kumar R, Ahmad N. Cancer chemoprevention by resveratrol: in vitro and in vivo studies and the underlying mechanisms. Int J Oncol. 2003;23:17–28. [PubMed] [Google Scholar]
  17. Davis RJ. Signal transduction by the JNK group of MAP kinases. Cell. 2000;103:239–52. [PubMed] [Google Scholar]
  18. Williams DL. Review: oxidation, antioxidants and cataract formation:a literature review. Vet Ophthalmol. 2006;9:292–8. [PubMed] [Google Scholar]
  19. Ray S, Bagchi D, Lim PM, Bagchi M, Gross SM, Kothari SC, Preuss HG, Stohs SJ. Acute and long-term safety evaluation of a novel IH636 grape seed proanthocyanidin extract. Res Commun Mol Pathol Pharmacol. 2001;109:165–97. [PubMed] [Google Scholar]
  20. Yokoyama T, Sasaki H, Giblin FJ, Reddy VN. A physiological level of ascorbate inhibits galactose cataract in guinea pigs by decreasing polyol accumulation in the lens epithelium: a dehydroascorbate-linked mechanism. Exp Eye Res. 1994;58:207–18. [PubMed] [Google Scholar]
  21. Creighton MO, Ross WM, Stewart-DeHaan PJ, Sanwal M, Trevithick JR. Modeling cortical cataractogenesis. VII: effects of vitamin E treatment on galactose-induced cataracts. Exp Eye Res. 1985;40:213–22. [PubMed] [Google Scholar]
  22. Li WC, Kuszak JR, Dunn K, Wang RR, Ma W, Wang GM, Spector A, Leib M, Cotliar AM, Weiss M. Lens epithelial cell apoptosis appears to be a common cellular basis for non-congenital cataract development in humans and animals. J Cell Biol. 1995;130:169–81. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
  23. Arends MJ, Wyllie AH. Apoptosis: mechamsms and roles in pathology. Int Rev Exp Pathol. 1991;32:223–54. [PubMed] [Google Scholar]
  24. Huang L, Estrada R, Yappert MC, Borchman D. Oxidation-induced changes in human lens epithelial cells. Phospholipids. Free Radic Biol Med. 2006;41:1425–32. [PubMed] [Google Scholar]
  25. Ottonello S, Foroni C, Carta A, Petrucco S, Maraini G. Oxidative stress and age-related cataract. Ophthalmologica. 2000;214:78–85. [PubMed] [Google Scholar]
  26. Truscott RJ. Age-related nuclear cataract-oxidation is the key. Exp Eye Res. 2005;80:709–25. [PubMed] [Google Scholar]
  27. Mathé G. Red wine, green tea and vitamins: do their antioxidants play a role in immunologic protection against cancer or even AIDS? Biomed Pharmacother. 1999;53:165–7. [PubMed] [Google Scholar]
  28. Caderni G, De Filippo C, Luceri C, Salvadori M, Giannini A, Biggeri A, Remy S, Cheynier V, Dolara P. Effects of black tea, green tea and wine extracts on intestinal carcinogenesis induced by azoxymethane in F344 rats. Carcinogenesis. 2000;21:1965–9. [PubMed] [Google Scholar]
  29. Sies H. Introductory remarks. In: Sies H, editor. Oxidative stress. London: Academic Press; 1985. p. 1-9. [Google Scholar]
  30. Halliwell B, Cross CE. Oxygen-derived species: their relation to human disease and environmental stress. Environ Health Perspect. 1994;102:5–12. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
  31. Williams DL. Review: oxidation, antioxidants and cataract formation:a literature review. Vet Ophthalmol. 2006;9:292–8. [PubMed] [Google Scholar]
  32. Beebe DC. The lens. In: Kaufman PL, Alm A, editors. Adler's physiology of the eye. 10th ed. St Louis: Mosby Year Book Inc; 2003. p. 117-58. [Google Scholar]
  33. Colitz CMH, Bomser JA, Kusewitt DF. The endogenous and exogenous mechanisms for protection from ultraviolet irradiation in the lens. Int Ophthalmol Clin. 2005;45:141–55. [PubMed] [Google Scholar]
  34. Li WC, Kuszak JR, Dunn K, Wang RR, Ma W, Wang GM, Spector A, Leib M, Cotliar AM, Weiss M, Espy J, Howard G, Farris RL, Auran J, Donn A, Hofeldt A, Mackay C, Merriam J, Mittl R, Smith TR. Lens epithelial cell apoptosis appears to be a common cellular basis for non-congenital cataract development in humans and animals. J Cell Biol. 1995;130:169–81. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
  35. Foresti R, Goatly H, Green CJ, Motterlini R. Role of heme oxygenase-1 in hypoxia-reoxygenation: requirement of substrate heme to promote cardioprotection. Am J Physiol. 2001;281:H1976–84. [PubMed] [Google Scholar]
  36. Ragione FD, Cucciolla V, Borriello A, Pietra VD, Racioppi L, Soldati G, Manna C, Galletti P, Zappia V. Resveratrol arrests the cell division cycle at S/G2 phase transition. Biochem Biophys Res Commun. 1998;250:53–8. [PubMed] [Google Scholar]
  37. Zoberi I, Bradbury CM, Curry HA, Bisht KS, Goswami PC, Roti Roti JL, Gius D. Radiosensitizing and antiproliferative effects of resveratrol in two human cervical tumor cell lines. Cancer Lett. 2002;175:165–73. [PubMed] [Google Scholar]
  38. Szende B, Tyihak E, Kiraly-Veghely Z. Dose-dependent effect of resveratrol on proliferation and apoptosis in endothelial and tumor cell cultures. Exp Mol Med. 2000;32:88–92. [PubMed] [Google Scholar]
  39. El-Mowafy AM, White RE. Resveratrol inhibits MAPK activity and nuclear translocation in coronary artery smooth muscle:reversal of endothelin-1 stimulatory effects. FEBS Lett. 1999;451:63–7. [PubMed] [Google Scholar]
  40. Roth S, Shaikh AR, Hennelly MM, Li Q, Bindokas V, Graham CE. Miotgen-activated protein kinases and retinal ischemia. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2003;44:5383–95. [PubMed] [Google Scholar]
  41. She Q-B, Bode AM, Ma W-Y, Chen N-Y, Dong Z. Resveratrol-induced activation of p53 and apoptosis is mediated by extracellular-regulated protein kinases and p38 kinase. Cancer Res. 2001;61:1604–10. [PubMed] [Google Scholar]
  42. Ono K, Han J. The p38 signal transduction pathway: activation and function. Cell Signal. 2000;12:1–13. [PubMed] [Google Scholar]